01、知识讲座
经典中枢神经系统
包括硬脑膜、软脑膜、硬脑膜窦、蛛网膜、颅骨等。
脑脊液在中枢神经系统中的作用：营养与支持、缓冲与保护、连接与代谢的作用。有研究者将脑脊液称为颅内淋巴。
杨又医师所在的团队对于脑内代谢物质的代谢途径，脑脊液的免疫作用进行了研究，研究表明，脑脊液和组织液可以通过星形胶质细胞上的水通道蛋白AQP-4进行直接交换，或者部分代谢产物可以直接进入脑膜淋巴管，汇入外周淋巴系统完成代谢物质的清除。
人类大脑可以利用水通道蛋白和淋巴管进行物质交换，但目前研究认为啮齿类动物仅在颅底存在淋巴管，如何实现物质交换也许还存在未知的结构。
本文来自于2023年Science杂志，分别由来自哥本哈根大学健康和医学科学学院细胞和分子医学系、美国罗切斯特大学医学中心神经胶质疾病和治疗中心的两位医生共同完成。
其中，哥本哈根大学健康和医学科学学院细胞和分子医学系的作者从1997年致力于大脑皮层表面相关研究。
摘要
●中枢神经系统的脑膜由硬脑膜、蛛网膜和软脑膜构成，在啮齿类动物和人脑中存在第四层脑膜，将蛛网膜下腔分隔开来，称为蛛网膜下淋巴管样膜(SLYM)
●SLYM的形态和免疫表型类似于外周器官和体腔的间皮细胞，包裹着血管和免疫细胞
●在功能上，SLYM与脑膜静脉窦内皮细胞的紧密链接允许脑脊液和静脉血之间直接交换
●SLYM的发现对于进一步理解脑内代谢物质的清除和免疫功能具有十分重要的意义
过程
●验证蛛网膜下腔存在SLYM
通过双光子显微镜发现，蛛网膜下腔存在绿色荧光标记的蛛网膜下淋巴样管膜(SLYM)，硬脑膜血管被胶原纤维包围，而SLYM覆盖蛛网膜下腔血管。
●SLYM的物理和化学性质
通透性：作者注射了1μm的红/蓝色荧光体的微球蛋白，荧光标记将蛛网膜下腔分成上浅层和下深层，且不可交换，因此得出结论，SLYM对大分子微球蛋白不具有通透性。
向实验大鼠注入TMR-葡聚糖：3kDa，脑脊液示踪剂，生理情况下，3kDa的小分子无法通过SLYM。大多数多肽和蛋白质的分子量大于3kDa，SLYM不允许大部分多肽和蛋白质通过。病理状态下，脑部出血，SLYM的连续性断裂，通透性发生改变。
●SLYM的独特细胞特征
通过对大鼠整个大脑进行染色，CRABP2标记SLYM，发现SLYM连续整齐存在于大鼠大脑周围。
通过不同抗体对SLYM进行标记，SLYM具有PDPN+、CRABP2+的细胞特征——淋巴管标志物
LYVE1——淋巴管内皮细胞受体阴性
人类大脑同样在蛛网膜下腔存在有PDPN+、CRABR2+的独特细胞特征的膜。特异性标记蛛网膜和SLYM，结构上与蛛网膜区分开，特异性标记蛛网膜小梁和SLYM，结构上与蛛网膜小梁区别开。
SLYM特征：
PDPN+ CRABP2+ LYVE1-
功能上与传统的三层脑膜区别开
SLYM具有独特的淋巴样特征
体腔内间皮细胞与SLYM同样表达PDPN+，SLYM具有与外周间皮细胞类似的边界润滑剂作用，保护大脑组织。通过免疫组织化学染色，发现SLYM与静脉窦直接接触，直接进行物质交换，起到代谢作用。
●SLYM在中枢神经系统中具有重要的免疫作用
结论
●啮齿类动物和人类大脑存在第4层脑膜-SLYM
●确定SLYM存在及结构
●SLYM的通透性——通过两个特殊的实验——不允许大分子多肽及蛋白质的通过
●通过一组特殊标记和染色——SLYM具有独特的、区别于其他脑膜的淋巴特征
●SLYM具有类间皮细胞的边界润滑剂作用
●SLYM内含免疫细胞，具有重要免疫作用
局限性
●后续从机制层面证明SLYM的完整作用
●人类免疫细胞具有个体差异性，SLYM的存在是否在每个人中都具有共性?
应用
●脑创伤后，阿尔茨海默病的风险增高，是否与SLYM破裂后，大分子蛋白质的通过有关?
●创伤性脑损伤后神经炎症延长，是否与SLYM的对免疫细胞的招募和聚集有关?
●展望：麻醉药物的脑保护作用
静脉输注低剂量右美托咪定(0.1g·kg·h)能够降低老年患者非心脏手术后谵妄的发生，右美托咪定——抑制去甲肾上腺素能系统的药物——神经保护效应，是否与SLYM清除代谢产物有关?
总结
本文作者通过一系列的实验:
●确认了蛛网膜下腔存在这一特殊的第四层脑膜结构
●展示了SLYM膜的解剖位置、物理性质、独特的功能属性及作用
●留下了许多的问题和值得探索的方向，如:药物的作用、疾病的病理生理机制、中枢神经炎症的发生发展、麻醉药物的脑保护作用，及术后谵妄的减少等
●更新和丰富了解剖知识
02
讨论环节
律峰医师：文章在杂志上篇幅并不多，文中采用的方法、设计也并不难，但这篇文章带来的信息和启示值得讨论和点评。人脑是人体最为复杂的器官，近几十年来脑健康成为全人类共同关注与维护的主题，SLYM的发现颠覆了传统解剖学的认知，这些对大脑的认识及相关疾病的治疗非常有帮助，可能会开启SLYM一系列相关疾病研究。
邓碧教授：作为一名临床麻醉医生，个人对于解剖基础类研究文献涉猎不多。这篇文献非常严谨，层层递进，是可以载入教科书的。作者通过表观免疫标记确定了内膜的存在，同时对硬脑膜、软脑膜、蛛网膜进行区分与鉴别诊断，把SLYM、蛛网膜、蛛网膜小梁进行了区分，证明了SLYM是区别于常规三种膜，独立存在的第四层脑膜组织。最后对SLYM的功能进行了论证，验证了它的屏障作用、免疫功能等，这种逐一验证、层层递进的方法对于临床与基础研究是很好的思路借鉴。
脑淋巴组织系统的发现史非常有趣，1914年，一位教授提出学说，大脑不存在淋巴组织系统。到了2012年，美国杰弗尔教授和他的团队采用双光子技术发现了脑胶质和淋巴途径。2015年，美国吉尼亚大学一位教授和他的团队首次发现了脑膜淋巴管，然后今天这篇文献发现了第四层脑膜存在免疫功能。发现SLYM对临床具有指导意义。随着人口老龄化，老年病人渐多，围术期认知功能障碍（PND）常见于65岁以上患者，中国发病率达到11%。此类患者发病机制不明，神经炎症学比较流行。手术刺激会促进炎症介质和细胞的释放，大于65岁的老年患者是否在SLYM功能出现改变后增加炎症介质通透性，损伤脑神经，引起PND？SLYM对于PND机制的研究及不良反应的处理提供了新切入点。
律峰医师：二三十年前，大家对于脑淋巴系统都持否认态度，但越来越多研究支持证明下，大家对脑淋巴系统有了更多认可。免疫系统无处不在，以这次新冠为例，新冠并不是单纯的呼吸或肺部问题，也会存在脑部认知问题、嗅觉感觉出错等。在病毒攻击免疫系统时，脑内可能也会有影响。文章建立于作者对脑部结构常年累月的研究，观察到了不同的结构，并使用简单方法进行验证。从事临床工作时，注意收集总结可能也会有新的发现。
陶艺教授：实验设计的基本步骤包括：明确提出问题、实验目的，确定实验对象、可比实验组/对照组、样本量、实验方法和指标，确定偏移和控制等。传统认知中脑膜有三层，但随着研究的进步，许多关于大脑的固有认知都被打破，正如邓教授提到的脑淋巴系统的发现历史。本实验来源于研究团队的猜想，外周脏器表面存在的间皮层（包裹并保护脏器，同时含有免疫细胞），在大脑中是否也存在？这就是本研究的主要问题。如果存在，它对物质的通透性如何？它与蛛网膜的结构是否相同？除了物质交换是否还有其他功能。研究团队通过提出细节问题，进行了一系列深入探究。第二，本研究的实验对象是大鼠。第三，为了进一步实现和探索提出的研究假设，研究团队根据问题选择了实验方法和评价指标。如SLYM通透性探究中，用红/蓝色荧光微球蛋白注射到蛛网膜，用双光子显微镜进行观察，从而得出它的物理结构，浅层和深层之间的交换又进一步证明了SLYM与蛛网膜是不同的膜结构，还对它的功能进行了探索，最后得出了结论。这项研究运用的统计方法比较简单，双侧非配对T检验，对于方差不齐的两组比较时用了Welch矫正。
实验动物是构建研究模型的必备素材，样本量不够会影响检验效能。出于对动物伦理的保护，各种临床试验相关的指南都对样本量进行了详尽的规范，明确要求动物实验报告解释实验动物所需的样本量，以及估算的详细信息。探索性临床研究以观察为主，没有基础数据，无法估算样本量。动物实验和临床研究样本量的估算原理是相同的，都需要通过对研究的效应量估计所需样本量，统计分析得到可靠的结论。动物实验常用基于功效检验的样本量估算、基于效益递减法法则的样本量估算，它通过方差分析的自由度来估算。自由度取值范围一般在10-20之间，小于十增加数量，大于二十需减少数量。从动物实验衍生到人体实验，需要更加严谨的考量，包括研究设计类型等。对于本研究发现，是否应该扩大样本量、更换动物属种继续证明解剖结构，对临床的应用价值和药物研发又有哪些帮助？这些都值得进一步探究。
律峰医师：实验在保证科学性的同时，还要特别注意动物伦理问题。本文在证明SLYM存在时没有使用统计学方法，那么SLYM在不同种族，不同性别中是否会有不同，这篇文章是探索的起点，后续研究依然还在路上。最重要的是新发现如何回馈临床，治疗疾病。
袁保红医师：这篇文章今年年初在Science杂志上发表，人类对大脑的探索始于对解剖的认识。由于当时的技术、时代限制，他们对脑部的解剖和结构理解非常有限。17世纪，荷兰解剖学家首次完整描述了脑膜的存在；18世纪，瑞士的解剖学家更加详细地描述了脑膜的三层结构，从外到内分别是硬脑膜，蛛网膜和软脑膜；19世纪，法国的解剖学家发现了脑脊液的存在，提出脑膜是保护脑部的重要结构。20世纪以后开始使用更多技术观察脑部结构，脑部淋巴系统、脑膜淋巴管、SLYM相继被发现，新的技术和工具照亮了大脑复杂的解剖结构。科技大力推动医学研究的进步，新技术、新方法到新理论体系的形成，间隔时间越来越短。SLYM的发现打破了传统认知，将蛛网膜下腔分为了浅层和深层，这是麻醉医生平时打腰麻药物的目标位置，这两部分应该是本来就存在的，只是之前没有区分开来。它既是保护的屏障，也是免疫的屏障，监测大脑感染和炎症的平台。在外周脏器表面存在间皮层，提供润滑，防止器官和胸膜、腹膜之间摩擦，大脑表面是否存在类似结构就成为了他们的猜想，最终通过一系列验证得到了理想的结果。
从表面意思理解，脑膜是保护脑组织的膜结构，支持和保护大脑，对脑组织的研究也集中于神经元和胶质细胞，脑实质、脑膜、脑膜结构是否存在关联也有疑问。近年来研究也越来越重视对脑膜作用的研究，脑膜细胞与新型胶质细胞对应分布并凭借凸起彼此连接，为脑膜胶质细胞免疫调节网络的存在提供了形态学的依据。大量研究表明脑膜细胞有很多酶类，在免疫应激时，脑膜往往是先于脑实质出现反应，脑膜不仅有保护脑实质的作用，还可以形成脑内膜屏障，参与免疫调节。有研究发表过脑淋巴管在抗肿瘤方面的关键作用，脑膜与淋巴系统密切相关，SLYM功能特征提供了大脑免疫屏障和液体运输作用，为进一步研究大脑疾病打开了大门。SLYM的发现对于麻醉临床工作中没有什么明显改变，但对于研究麻醉药物、脑功能方面会有很多启示，相信随着科学的进步，科学家终究会打开大脑的黑匣子，解开更多秘密。
律峰医师：听了几位专家的分享，个人也产生了一些感想，SLYM作为一种物理屏障，可能会影响到药物的扩散，物质的转运等。SLYM是否存在于脊神经周围，做蛛网膜下隙麻醉时，如果麻醉针没有突破SLYM，麻药在蛛网膜下腔浅层是否会影响到麻醉效果？到了深层之后，麻醉效果又如何？它是否可以解释打腰麻时脑脊液流出，给药镇痛效果不好的原因？SLYM具有免疫功能，软脑膜、蛛网膜、硬脑膜是否也可能存在其他免疫功能？
回归到这篇文章，其中有很多创新点，比如常见蛋白无法通过SLYM，但在脑缺血、创伤时蛋白是可以穿透SLYM，这一点非常有趣。做研究往往通过一种方式证明，结果是笃定的，作者则是通过多种方式证明，深挖了SLYM物理通透性。因为用现有的理论无法完全解释脑淋巴系统的运转，不同的物种之间也存在较大差异，作者就猜测是否存在其他系统。这种思维需要在平时的研究过程中扎根，才能得到更多新发现。
杨又医师：陶艺教授提到，动物实验原则除考虑到动物的减损率外，还要遵循伦理原则；邓碧教授认为，PND机制研究可能与SLYM息息相关；袁保红医师建议重视脑膜作用，随着科技进步，或许可以通过更多先进技术发现更多未知领域。SLYM的存在对中枢神经系统脑膜做了补充，中枢神经系统对外周有调控作用，当外周发生疾病，中枢神经系统需要对此进行代偿性活动，SLYM是否在中枢神经系统疾病发生发展中起到了一定调控作用，也是值得研究和讨论的问题。SLYM厚度只有14μm，工作当中进行腰麻或者硬膜外麻醉，它是否有影响，相信这也是未来研究的方向。律峰教授提到，之前发现的三层脑膜有一定的忽略，通过研读本文也许会对原本存在的解剖结构有不同的想法和认识。
03、会议总结
今天的讨论意义非凡，相信在线的各位嘉宾与线上的学生都对SLYM的功能、病理、生理机制有了一定了解。有兴趣者可以在基础研究中展开探索，开辟更多新领域。
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